1996年に、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (リアルタイムqPCR) が米国のAppliedBiosystemsによって最初に導入されました。 いわゆるリアルタイムqPCRは、蛍光シグナルを継続的にモニターするために、PCR反応に蛍光基を付加することを指す。 外観の順序と信号強度の変化を使用して、ターゲット遺伝子の初期量をリアルタイムで分析できます。 この技術の発明は、定性的PCRから定量的PCRへの飛躍を実現する。
現在、リアルタイムqPCRは、使用されるさまざまな蛍光化学物質に応じて、蛍光色素と蛍光プローブの2つのカテゴリに分けられます。
蛍光色素は、DNA結合色素とも呼ばれる。 現在使用されている主な染料分子はSYBR Green Iである。 SYBR Green Iは、DNA二本鎖の小さな溝に特異的に結合することができます。 フリーSYBRグリーンIには蛍光シグナルはほとんどありませんが、二本鎖DNAに結合します。 その後、その蛍光シグナルは数百倍増加することができます。 PCR産物の増加に伴い、PCR産物と色素の結合量も増加し、蛍光シグナルの強度は二本鎖DNA分子の数を表します。
蛍光色素の利点は、それらが使いやすく、任意のPCR生成物と組み合わせることができ、そして安価であるということである。
一般に、SYBR Green I法は、最も基本的で一般的に使用されるリアルタイムqPCR実験の1つです。
リアルタイムqPCRで最も一般的に使用される蛍光プローブはTaqManプローブである。 基本的な原理は、標的遺伝子に特異的にハイブリダイズできるプローブを設計して合成することです。 プローブの5' 末端はフルオロフォアで標識され、3' 末端はクエンチャー基で標識される。
通常の状況では、2つのグループ間の空間距離は非常に近く、蛍光遺伝子は消光のために蛍光を発することができません。 PCR増幅中、プライマーとプローブは同時にテンプレートに結合し、プローブの結合位置は上流と下流のプライマーの間に位置します。
増幅がプローブが結合する位置まで広がると、Taq酵素は5 'エキソヌクレアーゼ活性を使用して、プローブの5' 末端に結合した蛍光分子をプローブから切断します。それを蛍光に引き起こします。 検出された蛍光分子の数はPCR生成物の数に比例するので、初期DNAテンプレートの数は、PCR反応系における蛍光強度に従って計算することができる。
TaqManプローブ技術は、蛍光色素と非特異的増幅の組み合わせの問題を解決します。 反応の後、テスト時間を短くする融解カーブ検出の必要性がありません。
TaqManプローブ技術の利点は、低い蛍光バックグラウンド、高い感度、高いハイブリダイゼーション安定性、優れた蛍光スペクトル分解能、および高い特異性です。
TaqManプローブの特異性が高いため、対立遺伝子の識別、特にヒト遺伝子多型、およびSNPに基づいて株を区別および定量化するために使用できます。