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1.リアルタイム定量的PCR

1996年に、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (リアルタイムqPCR) が米国のAppliedBiosystemsによって最初に導入されました。 いわゆるリアルタイムqPCRは、蛍光シグナルを継続的にモニターするために、PCR反応に蛍光基を付加することを指す。 外観の順序と信号強度の変化を使用して、ターゲット遺伝子の初期量をリアルタイムで分析できます。 この技術の発明は、定性的PCRから定量的PCRへの飛躍を実現する。

2.PCR蛍光で使用される化学物質

現在、リアルタイムqPCRは、使用されるさまざまな蛍光化学物質に応じて、蛍光色素と蛍光プローブの2つのカテゴリに分けられます。

3.PCR蛍光で使用される染料

蛍光色素は、DNA結合色素とも呼ばれる。 現在使用されている主な染料分子はSYBR Green Iである。 SYBR Green Iは、DNA二本鎖の小さな溝に特異的に結合することができます。 フリーSYBRグリーンIには蛍光シグナルはほとんどありませんが、二本鎖DNAに結合します。 その後、その蛍光シグナルは数百倍増加することができます。 PCR産物の増加に伴い、PCR産物と色素の結合量も増加し、蛍光シグナルの強度は二本鎖DNA分子の数を表します。

蛍光色素の利点は、それらが使いやすく、任意のPCR生成物と組み合わせることができ、そして安価であるということである。

一般に、SYBR Green I法は、最も基本的で一般的に使用されるリアルタイムqPCR実験の1つです。

4.PCR蛍光のためのプローブ

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

通常の状況では、2つのグループ間の空間距離は非常に近く、蛍光遺伝子は消光のために蛍光を発することができません。 PCR増幅中、プライマーとプローブは同時にテンプレートに結合し、プローブの結合位置は上流と下流のプライマーの間に位置します。

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

TaqManプローブ技術は、蛍光色素と非特異的増幅の組み合わせの問題を解決します。 反応の後、テスト時間を短くする融解カーブ検出の必要性がありません。

TaqManプローブ技術の利点は、低い蛍光バックグラウンド、高い感度、高いハイブリダイゼーション安定性、優れた蛍光スペクトル分解能、および高い特異性です。

TaqManプローブの特異性が高いため、対立遺伝子の識別、特にヒト遺伝子多型、およびSNPに基づいて株を区別および定量化するために使用できます。